刺槐(Robinia pseudoacacia L.)，属蝶形花科(Fabaceae)或豆科(Leguminosae)蝶形花亚科(Papilionoideae)刺槐属(Robinia L.)落叶乔木，是一种良好的用材、水土保持、防风固沙、土壤改良和绿化树种，此外还是一种优良的木本蜜源树种和高蛋白饲料树种，其适生范围广、耐低温、耐干旱瘠薄、耐盐碱，因而被广泛引种种植。刺槐于1898年引入我国，目前已逐步演化为我国的一个乡土树种(Huo et al., 2009)。

序列扩增相关多态性SRAP (sequence-related amplified polymorphism)是由Li和Quiros发明的一种新型分子标记技术，主要对开放阅读框进行扩增，正向和反向引物分别由17和18个碱基组成。具有在基因组中分布均匀，多态性高，产率中等，操作简单，重复性好，以及引物具有通用性等优点(Li and Quiros, 2001)。在林木中国内外学者利用SRAP标记技术进行了包括体系优化、遗传多样性分析、杂种鉴定、遗传连锁图谱构建以及QTL分析等在内的大量工作，物种涉及杨树(Wang et al., 2010)、柑橘(Osman et al., 2010; 吴鑫等, 2008)、红松(Chen et al., 2010)、糖槭(Sreedhar et al., 2008; 2009)、芭蕉(Muhammad et al., 2010)、美国脐橙(An et al., 2008)、菠萝(邱文武等, 2008)、龙眼(赵玉辉等, 2009)、落羽杉属树木(於朝广等, 2009)、葡萄(郭大龙等, 2010)、荔枝(昝逢刚等, 2009)、甘薯(吴洁等, 2005; 李爱贤等, 2008)等。

目前，对于刺槐树种而言，开发的可供利用的SSR引物仅为21条(Lian et al., 2002, 2004; Kentaro et al., 2008)，因而很难满足实际需要，而AFLP技术尽管引物具有通用性，但是其操作复杂，且成本较高，这些因素极大地限制了刺槐分子标记辅助育种工作的开展。本研究采用正交试验设计同时结合单因素试验对刺槐SRAP-PCR反应体系中各主要成分(Mg²⁺, dNTPs, Taq DNA聚合酶, primer浓度和模板DNA量)进行优化，在此基础上利用优化的刺槐SRAP-PCR体系进行引物筛选，最终建立了适合刺槐的SRAP-PCR反应体系。为利用SRAP标记技术进行刺槐种质资源遗传多样性分析、指纹图谱构建以及刺槐分子标记辅助育种研究奠定了基础。

1结果与分析
1.1正交试验设计筛选
以普通二倍体刺槐DNA为模板，利用me13/em1引物组合对正交试验设计各组合反应体系进行扩增(见图1)。从图中可以看出，由于Mg²⁺、dNTPs、Taq DNA聚合酶、primer以及模板DNA浓度组合的不同，扩增结果之间表现出明显的差异。其中组合1、2、3、4、6、8、11、12、16无扩增条带或者扩增条带较弱，分析1、2、3、4组合，Mg²⁺处于最低浓度1.5 mmol/L，而其它因素处在不同的水平，组合6和8 Mg²⁺浓度也处于相对较低水平2.0 mmol/L，组合6、11、16的Taq DNA聚合酶处于最低水平0.5 U，组合12的primer浓度处于最低水平0.1 µmol/L。组合7和14虽然扩增出了条带，但条带数目较少。组合9、10、13、15均扩增出了较为清晰地条带，而在这些组合中dNTPs和DNA模板各个浓度梯度均有，Mg²⁺和Taq DNA聚合酶量处于较高水平。

图1 SRAP-PCR正交试验设计电泳 Figure 1 Electrophoresis result of SRAP-PCR orthogonal design

综合上述结果来看，Mg²⁺和Taq DNA聚合酶量为影响刺槐SRAP-PCR的关键因素，低浓度的Mg²⁺和Taq DNA聚合酶量不利于扩增，在保证基本扩增的前提下，dNTPs和DNA模板浓度并不是影响PCR的关键因素。

根据对扩增条带数目多少、清晰度、背景强弱等进行综合评价，初步筛选出组合9和10为最优组合，其次为组合15，13。

综合分析初步确定基本反应体系为Mg²⁺ 2.5 mmo1/L，dNTPs 0.2 mmol/L，Taq DNA聚合酶1.5 U，primer 0.4 µmol/L，模板DNA 30 ng。

1.2单因素实验
利用正交试验设计得出的基本反应体系，以普通二倍体刺槐DNA为模板，在保持其它因素不变的情况下依次变换单一因素，利用me2/em5引物组合进行扩增(见图2)。从图中可以看出，随着Mg²⁺浓度的增长，扩增产物在不断增加，当Mg²⁺浓度达到2.5 mmo1/L时，扩增条带基本稳定，从经济角度考虑结合正交试验结果，选择Mg²⁺浓度为2.5 mmo1/L。

图2 基本反应体系中各组分不同浓度对SRAP-PCR反应的影响 Figure 2 Effect of each component concentrations of SRAP-PCR patterns in basic reaction system

当dNTPs浓度为0.1和0.2 mmol/L时，扩增条带清晰且数目较多，随着dNTPs浓度的增加，扩增条带数目和清晰度逐渐下降。考虑到dNTPs浓度过低将会降低扩增产物量和扩增稳定性，结合正交试验结果选择dNTPs浓度为0.2 mmol/L。

当Taq DNA聚合酶量为0.5~1.0 U时，扩增条带数目较少，且不清晰，当Taq DNA聚合酶量为1.5~2.0 U时，扩增条带数目较多且清晰稳定，但是Taq DNA聚合酶量为2.0 U时，背景较深，因此，选择Taq DNA聚合酶量为1.5 U。

当primer浓度为0.1~0.2 µmol/L时，扩增条带数目较少且亮度较低，随着浓度的增加，扩增条带数目和清晰度均提高，但0.3 µmol/L 和0.4 µmol/L扩增结果无明显差别，考虑到引物浓度过高容易产生引物二聚体和从经济角度考虑，选择primer浓度为0.3 µmol/L。

4个DNA模板浓度均扩增出了较为清晰地条带，且条带之间无显著差别，考虑到过低浓度的模板DNA量容易造成扩增条带数目减少，而过高浓度的DNA量则容易造成非特异性扩增产物的出现，选择模板DNA量为30 ng。

综合考虑上述因素，最终确定25 µL SRAP-PCR反应总体系中各主要组分的最优组合为：Mg²⁺ 2.5 mmo1/L，dNTPs 0.2 mmol/L，Taq DNA聚合酶1.5 U，primer 0.3 µmol/L，模板DNA 30 ng。

1.3优化反应体系的验证及引物筛选
利用优化的刺槐SRAP-PCR反应体系，以航天诱变刺槐根部和叶片DNA、3个刺槐品种DNA和3份普通二倍体刺槐单株材料DNA为模板，选用引物组合 em4/me9进行SRAP-PCR优化体系验证(见图3)。从图中可以看出，各品种均扩增出了清晰稳定且多态性较为丰富的条带。表明优化后的反应体系适合于刺槐的SRAP-PCR反应。

图3 引物em4/me9对8份刺槐材料DNA的PCR扩增 Figure 3 PCR amplifications of 8 Robinia pseudoacacia L. DNA template by primer em4/me9

利用优化的刺槐SRAP-PCR反应体系对169个引物组合进行初步筛选和重复筛选，最终获得条带清晰、稳定、重复性好以及多态性丰富的引物组合35个。具体引物组合为：em1/me3、em1/me6、em1/me10、em2/me4、 em2/me5、em2/me6、em2/me9、em2/me11、em3/me1、em3/me4、em3/me9、em3/me10、 em3/me13、em4/me5、em4/me9、em4/me10、em4/me11、em4/me12、em4/me13、em5/me5、 em5/me6、em5/me9、em5/me10、em5/me12、em5/me13、em6/me4、em6/me6、em6/me10、 em6/me11、em6/me12、em6/me13、em9/me11、em9/me13、em11/me11、em12/me11。

2讨论
对于刺槐的遗传多样性研究、亲缘关系分析以及种质资源鉴定等方面目前可供利用的分子标记主要有RAPD、ISSR、AFLP、SSR，与SRAP分子标记相比，RAPD的重复性和可靠性较低；AFLP步骤繁琐、成本较高，且不能区分显隐性状；ISSR是基于SSR引物序列的一种分子标记，需要花费大量成本来开发引物；SSR虽然稳定性较高，操作简单，为一种可靠的共显性标记，但是其需要花费高成本来开发大量的特异性引物，在刺槐树种中，目前开发的可供利用的 SSR引物仅为21条，因而很难满足实际需要。由于SRAP分子标记不需要已知序列信息，引物具有通用性，且上下游引物可相互配对组合，多数SRAP标记在基因组中分布均匀，为一种共显性标记，因此在刺槐的相关分子生物学研究等方面将会体现出较大的价值(孙佳琦等, 2010)。

本研究通过正交试验设计结合单因素设计对刺槐SRAP-PCR反应体系进行优化，既利用了正交试验设计考虑各组分间相互影响和有效降低工作量的优点，同时利用了单因素试验简单快捷的优点，使优化获得的体系更加准确，通过单因素试验得到的结果与正交试验得到的最优组合基本吻合。优化获得的刺槐SRAP-PCR反应体系为25 µL总体系中各主要组分为：Mg²⁺ 2.5 mmo1/L，dNTPs 0.2 mmol/L，Taq DNA聚合酶1.5 U，primer 0.3 µmol/L，模板DNA 30 ng。郭大龙等(2010)采用同样的方法对葡萄SRAP-PCR反应体系进行了优化，刘龙洲等(2009)、王燕青和季孔庶等(2009)、邹小云等 (2010)、於朝广和殷云龙等(2009)、陈万胜等(2008)采用正交试验设计分别对甜瓜、牡丹、花生、落羽杉属树木、烟草SRAP-PCR体系进行了优化，均得到了适合于各自材料的最佳SRAP-PCR体系，表明利用这种方法进行体系优化是有效地。

本研究优化获得的SRAP- PCR最佳反应体系经验证结果稳定、可靠，在此基础上筛选获得了适合于刺槐的扩增条带清晰，重复性好以及多态性丰富的引物35对，这将为利用SRAP分子标记开展刺槐遗传多样性分析、指纹图谱构建、分子标记辅助育种以及基因克隆等研究工作奠定基础。

3材料与方法
3.1供试材料
本实验选用普通二倍体刺槐为体系优化材料，采自北京市延庆县米家堡苗圃。利用刺槐品种二季红花槐、箭杆1号、鲁刺9号，航天诱变刺槐，以及普通二倍体刺槐不同单株材料3份(单株材料1, 2, 3)来验证优化后的反应体系，其中二季红花槐、箭杆1号、鲁刺9号采自山东临沂费县大青山林场，航天诱变刺槐(经实践八号育种卫星搭载返地后种植获得的实生苗)采自北京市延庆县风沙源苗圃，普通二倍体刺槐单株材料采自北京市延庆县米家堡苗圃。

3.2实验试剂
DNA聚合酶、dNTPs、DL2000 DNA Marker等分别购白Promega、Biodee、TaKaRa公司，SRAP引物根据Li等(Li and Quiros, 2001)提出的原则设计，由上海捷瑞生物工程有限公司合成，具体序列信息见表1。

表1 SRAP引物序列信息 Table 1 The primer sequences used in SRAP analysis

3.3基因组DNA提取
采集刺槐幼嫩叶片和根，利用天根生化科技(北京)有限公司的新型植物基因组DNA提取试剂盒依照操作指南进行基因组DNA提取。提取到的DNA采用琼脂糖凝胶电泳和NanoVue超微量分光光度计检测完整性和质量。

3.4 SRAP-PCR反应条件
SRAP -PCR扩增采用如下程序：94℃ 5 min；94℃ l min，35℃ l min，72℃ 1.5 min，5个循环；94℃ 1 min，50℃ 1 min，72℃ 1.5 min，35个循环；72℃ 10 min，10℃保存。扩增产物在8%的聚丙烯酰胺凝胶电泳中电泳，银染检测并用数码相机照相。

3.5 SRAP-PCR反应体系优化
刺槐SRAP-PCR反应体系优化正交试验设计所用引物组合为me13/em1，单因素试验所用引物组合为me2/em5。先利用L₁₆(4⁵)正交试验设计进行5因素4水平的筛选分析，因素水平及正交试验设计见表2和表3。在初步筛选获得较优组合的基础上进行单因素试验，基本反应体系为25 µL总反应体系中包含Mg²⁺ 2.5 mmo1/L，dNTPs 0.2 mmol/L，Taq DNA聚合酶1.5 U，primer 0.4 µmol/L，模板DNA 30 ng，保持其它因素不变的情况下依次变换单一因素，筛选最优反应参数。

表2 SRAP-PCR优化反应中的各因素水平 Table 2 Each factors and levels of SRAP-PCR optimization reaction

表3 SRAP-PCR反应中各因素水平的L16(45)正交试验设计 Table 3 L16(45) orthogonal design of each factors and levels of SRAP-PCR reaction

3.6反应体系验证
利用优化的刺槐SRAP-PCR反应体系，选用引物组合em4/me9对3个刺槐品种(二季红花槐, 箭杆1号, 鲁刺9号)、航天诱变刺槐根部和叶片基因组DNA和普通二倍体刺槐材料3份(材料1, 2, 3)进行SRAP-PCR扩增，以验证优化后的反应体系的稳定性及可靠性。

3.7引物筛选
以普通二倍体刺槐为材料，利用优化的刺槐SRAP-PCR反应体系，对169个引物组合进行初步筛选，获得条带清晰、稳定、重复性好的引物组合，在此基础上以3个刺槐品种(二季红花槐, 箭杆1号, 鲁刺9号)为材料，对初步筛选获得的引物组合进行重复筛选，获得条带清晰、稳定、重复性好以及多态性丰富的引物组合。

作者贡献
袁存权是本研究的实验设计和实验研究的执行人；袁存权完成数据分析，论文初稿的写作；李允菲、杨妮娜、戴丽参与实验设计和实验结果的处理和分析；胡瑞阳、孙鹏参与了实验材料的采集和样品处理工作；荀守华参与了山东临沂费县大青山林场部分刺槐实验材料的采集工作；李云是项目的负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者均阅读并同意论文最终文本。

致谢
本研究由饲料型刺槐多倍体品种选育及产业化关键技术研究(201104013)项目资助。

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